Makalah Antibodi monoklonal
oleh: T. Jonathan sianturi
antibodi
monoklonal
I. Pengertian Antibodi Monoklonal
adalah antibodi sejenis yang diproduksi oleh sel plasma klon sel-sel positif
sejenis. Antibodi ini dibuat oleh sel-sel hibridoma (hasil fusi 2 sel berbeda;
penghasil sel positif Limpa danselmieloma)yangdikultur.Bertindak sebagai
antigen yang akan menghasilkan anti bodi adalah limpa. Fungsi antara lain
diagnosis penyakit dan kehamilan.Antibodi monoklonal adalah zat yang diproduksi
oleh sel gabungan tipe tunggal yang memiliki kekhususan tambahan. Ini adalah
komponen penting dari sistem kekebalan tubuh. Mereka dapat mengenali dan
mengikat ke antigen yang spesifik. Pada teknologi antibodi monklonal, sel tumor
yang dapat mereplikasi tanpa henti digabungkan dengan sel mamalia yang
memproduksi antibodi. Hasil penggabungan sel ini adalah hybridoma, yang akan
terus memproduksi antibodi. Antibodi monoklonal mengenali setiap determinan
yang antigen (bagian dari makromolekul yang dikenali oleh sistem kekepalan
tubuh / epitope). Mereka menyerang molekul targetnya dan mereka bisa memilah
antara epitope yang sama. Selain sangat spesifik, mereka memberikan landasan
untuk perlindungan melawan patogen. Antibodi monoklonal sekarang telah
digunakan untuk banyak masalah diagnostik seperti : mengidentifikasi agen
infeksi, mengidentifikasi tumor, antigen dan antibodi auto, mengukur protein
dan level drug pada serum, mengenali darah dan jaringan, mengidentifikasi sel
spesifik yang terlibat dalam respon kekebalan dan mengidentifikasi serta
mengkuantifikasi hormon.
II.Cara Memproduksi Antibodi Monoklonal (Hibridoma)
PENERAPAN ANTIBODI MONOKLONAL
Makrofag telah mengidentifikasikan sel kanker. Ketika melampaui batas
menyatukan dengan sel kanker, makrofag (sel putih yang lebih kecil) akan
menyuntikan toksin yang akan membunuh sel tumor. Imunoterapi untuk perawatan
kanker merupakan salah satu hal yang diteliti oleh penelitian medis.
Peran penting imunitas lainnya adalah untuk menemukan dan menghancurkan tumor.
Sel tumor menunjukan antigen yang tidak ditemukan pada sel normal. Untuk sistem
imun, antigen tersebut muncul sebagai antigen asing dan kehadiran mereka
menyebabkan sel imun menyerang sel tumor. Antigen yang ditunjukan oleh tumor
memiliki beberapa sumber; beberapa berasal dari virus onkogenik seperti
papillomavirus, yang menyebabkan kanker leher rahim, sementara lainnya adalah
protein organisme sendiri yang muncul pada tingkat rendah pada sel normal
tetapi mencapai tingkat tinggi pada sel tumor. Salah satu contoh adalah enzim
yang disebut tirosinase yang ketika ditunjukan pada tingkat tinggi, merubah
beberapa sel kulit (seperti melanosit) menjadi tumor yang disebut
melanoma.Kemungkinan sumber ketiga antigen tumor adalah protein yang secara
normal penting untuk mengatur pertumbuhan dan proses bertahan hidup sel, yang
umumnya bermutasi menjadi kanker membujuk molekul sehingga sel termodifikasi
sehingga meningkatkan keganasan sel tumor. Sel yang termodifikasi sehingga
meningkatkan keganasan sel tumor disebut onkogen.
Respon utama sistem imun terhadap tumor adalah untuk menghancurkan sel abnormal
menggunakan sel T pembunuh, terkadang dengan bantuan sel T pembantu. Antigen
tumor ada pada molekul MHC kelas I pada cara yang mirip dengan antigen virus.
Hal ini menyebabkan sel T pembunuh mengenali sel tumor sebagai sel abnormal Sel
NK juga membunuh sel tumor dengan cara yang mirip, terutama jika sel tumor
memiliki molekul MHC kelas I lebih sedikit pada permukaan mereka daripada
keadaan normal; hal ini merupakan fenomena umum dengan tumor. Terkadang
antibodi dihasilkan melawan sel tumor yang menyebabkan kehancuran mereka oleh
sistem komplemen.
Beberapa tumor menghindari sistem imun dan terus berkembang sampai menjadi
kanker.Sel tumor sering memiliki jumlah molekul MHC kelas I yang berkurang pada
permukaan mereka, sehingga dapat menghindari deteksi oleh sel T pembunuh.
Beberapa sel tumor juga mengeluarkan produk yang mencegah respon imun;
contohnya dengan mengsekresikan sitokin TGF-β, yang menekan aktivitas makrofag
dan limfosit. Toleransi imunologikal dapat berkembang terhadap antigen tumor,
sehingga sistem imun tidak lagi menyerang sel tumor.
Makrofag dapat meningkatkan perkembangan tumor ketika sel tumor mengirim
sitokin yang menarik makrofag yang menyebabkan dihasilkannya sitokin dan faktor
pertumbuhan yang memelihara perkembangan tumor. Kombinasi hipoksia pada tumor
dan sitokin diproduksi oleh makrofag menyebabkan sel tumor mengurangi produksi
protein yang menghalangi metastasis dan selanjutnya membantu penyebaran sel
kanker.
Antibodi monoklonal adalah kelompok obat yang relatif baru, dan pengembangan
terapi ini merupakan salah satu kemajuan terbesar untuk pengobatan limfoma non
Hodgkin dalam beberapa tahun belakangan. Antibodi monoklonal yang paling umum
dipakai dalam pengobatan limfoma non Hodgkin adalah rituximab. Rituximab efektif
dalam pengobatan beberapa tipe limfoma non Hodgkin yang paling umum. Rituximab
umumnya diberikan dalam kombinasi dengan kemoterapi, meskipun pada beberapa
keadaan diberikan tunggal.
Pada banyak pasien, rituximab meningkatkan efektivitas dari pengobatan lain
(umumnya kemoterapi). Pada limfoma non Hodgkin indolen, rituximab dapat
meningkatkan lamanya masa remisi karena pengobatan. Pada limfoma non Hodgkin
agresif, tambahan rituximab pada kemoterapi standar (CHOP) telah terbukti
meningkatkan kemungkinan pasien untuk sembuh dan meningkatkan harapan hidup
dibanding kemoterapi saja.
Juga penting bahwa efek samping terkait infus rituximab umumnya hanya terjadi
saat obat diberikan dan berkurang pada dosis berikutnya, serta pemberian
bersamaan dengan kemoterapi tidak menyebabkan peningkatan efek samping karena
kemoterapi yang bermakna. Efek samping yang berlanjut lebih lama dari beberapa
menit atau jam sangat jarang dan umumnya tidak ada makna klinisnya .
CARA KERJA ANTIBODI MONOKLONAL
Tidak seperti kemoterapi dan radioterapi, yang bekerja secara kurang spesifik,
tujuan pengobatan antibodi monoklonal adalah untuk menghancurkan sel-sel
limfoma non Hodgkin secara khusus dan tidak mengganggu jenis-jenis sel lainnya.
Semua sel memiliki penanda protein pada permukaannya, yang dikenal sebagai
antigen. Antibodi monoklonal dirancang di laboratorium untuk secara spesifik
mengenali penanda protein tertentu di permukaan sel kanker. Antibodi monoklonal
kemudian berikatan dengan protein ini. Hal ini memicu sel untuk menghancurkan
diri sendiri atau memberi tanda pada siinduk kekebalan tubuh untuk menyerang
dan membunuh sel kanker.
Sebagai contoh, rituximab, antibodi monoklonal yang dipakai dalam pengobatan
limfoma non Hodgkin, mengenali penanda protein CD20. CD20 ditemukan di
permukaan Sel B abnormal yang ditemukan pada jenis-jenis limfoma non Hodgkin
yang paling umum.
Saat rituximab berikatan dengan CD20 di permukaan suatu sel-B, sel mungkin
dihancurkan langsung, tetapi pertahanan alami tubuh juga disiagakan. Rituximab
secara efektif menyerang sel limfoma agar dapat dihancurkan siinduk kekebalan
tubuh dan membunuh sel-sel kanker.
CD20 juga ditemukan di permukaan sel-B normal, salah satu jenis sel darah putih
yang beredar di tubuh. Ini berarti mungkin sel-B normal ini juga dihancurkan
saat rituximab digunakan. Akan tetapi, sel induk dalam sumsum tulang yang
berkembang menjadi sel-B tidak memiliki CD20 pada permukaannya.
Oleh karena itu sel induk tidak dihancurkan oleh rituximab dan dapat terus
menyediakan sel-B sehat untuk tubuh. Meskipun jumlah sel-B normal yang matang
berkurang untuk sementara karena pengobatan, mereka akan kembali ke kadar
semula setelah pengobatan.
DOSIS DAN PEMBERIAN ANTIBODI
Dosis dan pemberian bervariasi untuk setiap antibodi yang diberikan. Sebagai
contoh, rituximab, antibodi monoklonal yang umum digunakan dalam pengobatan NHL
diberikan intravena, melalui jarum yang masuk ke dalam pembuluh darah ,
biasanya di lengan. Rituximab diberikan sebagai ‘tetesan’ yang berarti obat
dimasukkan dulu ke dalam kantong infus, kemudian cairan menetes perlahan ke
dalam pembuluh darah dengan mengandalkan kekuatan gravitasi. Jika antibodi
monoklonal digunakan dalam kombinasi dengan kemoterapi, rituximab biasanya
diberikan sesaat sebelum kemoterapi pada awal setiap siklus pengobatan.
Sebelum tetesan infus diberikan, obat lain untuk mencegah beberapa efek samping
antibodi monoklonal diberikan – contohnya parasetamol untuk mengurangi demam
dan anti-histamin untuk mengurangi kemungkinan reaksi alergi. Meski demikian,
efek samping antibodi monoklonal umumnya ringan dan sementara serta dapat
diatasi dengan mudah.
Jika terjadi efek samping saat obat diberikan, tetesan infus dapat diperlambat
atau bahkan dihentikan hingga efek samping berakhir.
Untuk pengobatan pertama, pasien menginap di rumah sakit atau sementara tinggal
di sana sebelum pulang ke rumah. Pengobatan lanjutan biasanya lebih cepat dan
efek sampingnya lebih sedikit. Kebanyakan orang dapat mendapat pengobatan
lanjutan ini sebagai rawat-jalan dan pulang ke rumah pada hari itu juga.
EFEK SAMPING ANTIBODI MONOKLONAL
Seperti semua obat, antibodi monoklonal dapat menyebabkan efek samping.
Contohnya untuk rituximab, efek samping umumnya ringan dan bersifat sementara,
hanya berlangsung selama pengobatan atau beberapa jam setelahnya. Efek samping
terjadi paling sering selama masa pengobatan mingguan pertama, dan biasanya
berkurang dengan dosis selanjutnya. Hal ini disebabkan lebih banyak sel limfoma
selama pengobatan pertama yang harus diserang oleh antibodi monoklonal dan dihancurkan
oleh si induk kekebalan tubuh.
Efek samping yang paling umum adalah demam, menggigil dan gejala mirip flu
lainnya, seperti nyeri otot, nyeri kepala dan rasa letih. Umumnya cepat
berakhir setelah masa pengobatan berakhir. Kadang-kadang, pasien merasakan
flushing mendadak dan merasa panas di wajah. Hal ini biasanya berlangsung amat
singkat.
Beberapa pasien mengalami mual (mual) atau muntah. Obat anti muntah
(anti-muntah) umumnya sangat efektif dalam mencegah maupun meringankan
gejala-gejala ini sehingga lebih dapat ditoleransi.
Kadang-kadang, pasien merasakan nyeri pada bagian tubuh yang merupakan lokasi
limfoma. Nyeri biasanya ringan dan dapat diatasi dengan obat anti-nyeri biasa.
Rituximab dapat menyebabkan reaksi alergi. Gejalanya dapat berupa:
• Gatal atau mendadak muncul warna kemerahan
• Batuk, mengi atau sesak napas
• Lidah bengkak atau rasa bengkak di tenggorokan
• Edema, atau pembengkakan karena kelebihan cairan dalam jaringan tubuh
Reaksi alergi berat terhadap rituximab jarang ditemukan dan pasien diamati
selama masa pengobatan akan munculnya gejala-gejala ini. Pasien harus
melaporkan gejala yang dialaminya begitu muncul. Seringkali, yang perlu
dilakukan hanyalah memperlambat atau menghentikan sementara tetesan intravena
sampai reaksi alergi berakhir. Pasien umumnya diberikan anti-histamin sebelum
mulai pengobatan untuk membantu mencegah atau mengurangi masalah ini.
MATERI
Terapi antibodi monoklonal merupakan bentuk pasif dari imunoterapi, karena
antibodi dibuat dalam kuantitas besar di luar tubuh (di laboratorium). Jadi
terapi ini tidak membutuhkan sistem imun pasien untuk bersikap aktif melawan
kanker. Antibodi diproduksi secara masal dalam laboratorium dengan
menggabungkan sel myeloma (tipe kanker sumsum tulang) dari sel B mencit yang
menghasilkan antibodi spesifik. Sel hasil penggabungan ini disebut hybridoma.
Kombinasi sel B yang bisa mengenali antigen khusus dan sel myeloma yang hidup
akan membuat sel hibridoma menjadi semacam pabrik produksi antibodi yang tidak
ada habisnya. Karena semua antibodi yang dihasilkan identik, berasal dari satu
(mono) sel hibridoma, mereka disebut antibodi monoklonal (kadang disingkat
MoAbs atau Mabs).
Nama MAb Nama Dagang Digunakan pada kanker Disetujui
Rituximab Rituxan Non-Hodgkin lymphoma 1997
Trastuzumab Herceptin Breast cancer 1998
Gemtuzumab ozogamicin* Mylotarg Acute myelogenous leukemia (AML) 2000
Alemtuzumab Campath Chronic lymphocytic leukemia (CLL) 2001
Ibritumomab tiuxetan* Zevalin Non-Hodgkin lymphoma 2002
Tositumomab* Bexxar Non-Hodgkin lymphoma 2003
Cetuximab Erbitux Colorectal cancer
Head & neck cancers 2004
2006
Bevacizumab Avastin Colorectal cancer 2004
Dua tipe antibodi monoklonal yang digunakan untuk terapi kanker, adalah :
1. Naked monoclonal antibodies
Naked monoclonal antibodies atau antibodi monoklonal murni adalah antibodi yang
penggunaanya tanpa dikombinasikan dengan obat lain atau material radioaktif.
Antibodi murni mengikatkan diri mereka pada antigen spesifik milik sel-sel
kanker dengan berbagai cara. Misalnya, memberi tanda pada sel kanker agar bisa
dikenali dan dirusak oleh sistem imun tubuh. Cara lain dengan mengikatkan diri
pada antigen tertentu yang disebut reseptor, tempat di mana molekul-molekul
yang berfungsi menstimulasi pertumbuhan sel kanker juga akan mengikatkan diri.
Dengan menghambat molekul-molekul pertumbuhan untuk tidak mengikatkan diri,
maka antibodi monoklonal ini sama saja mencegah sel kanker untuk tumbuh dengan
cepat. Trastuzumab (Herceptin), yang merupakan MAb murni dan digunakan untuk
kanker payudara stadium lanjut, adalah contoh antibodi monoklonal yang bekerja
dengan cara ini.
Beberapa MAbs murni yang sudah disetujui FDA antara lain :
• Rituximab (Rituxan): Rituximab digunakan untuk terapi sel B pada non-Hodgkin
lymphoma. Agen ini merupakan antibodi monoklonal dengan sasaran antigen CD20,
yang ditemukan pada sel B.
• Trastuzumab (Herceptin): Trastuzumab adalah antibodi yang menyerang protein
HER2. Protein ini terlihat dalam jumlah besar pada sel-sel beberapa kasus
kanker payudara.
• Alemtuzumab (Campath): Alemtuzumab merupakan antibodi yang menyerang antigen
CD52, yang terlihat pada sel B maupun sel T. Agen ini digunakan untuk terapi B
cell lymphocytic leukemia (B-CLL) kronik yang sudah mendapat kemoterapi.
• Cetuximab (Erbitux): Cetuximab, antibodi dengan sasaran protein EGFR
(epidermal growth factor receptors). EFGR nampak dalam jumlah besar pada
beberapa sel kanker. Agen ini digunakan berbarengan dengan obat kemoterapi
irinotecan untuk kanker kolorektal stadium lanjut.
• Bevacizumab (Avastin): Bevacizumab bekerja melawan protein VEGF (Vascular
Endhotelial Growth Factor) yang normalnya membantu tumor membangun jaringan
pembuluh darah baru (proses angiogenesis) sebagai satu cara mendapatkan oksigen
dan nutrisi.
Efek Samping
Antibodi monoklonal diberikan intravena. Dibandingkan dengan efek samping
kemoterapi, efek samping naked MAbs atau MAbs murni biasanya lebih ringan dan
sering dikaitkan dengan reaksi “alergi”. Efek ini terlihat biasanya di awal
terapi, misalnya demam, menggigil, lemah, nyeri kepala, mual, muntah, diare,
tekanan darah turun, dan rashes. Beberapa MAbs juga bisa berimbas pada sumsum
tulang seperti halnya pada pemberian obat kemoterapi. Hal ini sebagai akibat
rendahnya kadar sel darah. Efek samping ini bisa memicu peningkatan risiko
pendarahan dan infeksi pada pasien.
` 2. Conjugated Monoclonal Antibodies
Conjugated monoclonal antibodies adalahantibodi yang dikombinasikan dengan
berbagai jenis obat, toksin, dan materi-materi radioaktif. Antibodi monoklonal
jenis ini akan berkeliling ke seluruh bagian tubuh sampai ia berhasil menemukan
sel kanker yang cocok dengan antigen yang ia bawa. Agen ini kemudian akan
menghantarkan racun di tempat paling krusial, namun hebatnya, ia bisa
meminimalkan dosis pada sel normal untuk menghindari kerusakan di seluruh
bagian tubuh.
Conjugated MAbs kadang dikenal juga sebagai "tagged,"
"labeled," atau "loaded" antibodies. Perbedaannya sebagai
berikut:
• MAbs yang dikombinasikan dengan obat-obat kemoterapi disebut chemolabeled.
Saat ini agen ini hanya tersedia di Amerika Serikat, itupun hanya dalam rangka
uji klinis.
• MAbs yang dikombinasikan dengan partikel radioaktif disebut radiolabeled, dan
tipe terapi ini sering juga disebut radioimmunotherapy (RIT). Pada 2002, FDA
menyetujui radiolabeled pertama yang boleh digunakan untuk terapi kanker (tak
hanya untuk uji klinis) yakni Ibritumomab tiuxetan (Zevalin). Obat ini
digunakan untuk terapi kanker B lymphocytes. Di samping untuk kanker, antibodi
radiolabeled juga digunakan bersamaan dengan kamera khusus untuk mendeteksi
penyebaran sel kanker dalam tubuh. Penggunaannya sudah disetujui FDA yakni
OncoScint (untuk deteksi kanker kolorektal dan kanker ovarium) serta
ProstaScint (deteksi kanker prostat).
• MAbs yang melekat dengan racun disebut immunotoxins. Imunotoksin dibuat
dengan menempelkan racun-racun (berasal dari tanaman maupun bakteri) ke
antibodi monoklonal. Berbagai racun dibuat untuk ditempelkan pada antibosi
monoklonal seperti diphtherial toxin (DT), pseudomonal exotoxin (PE40), atau
yang dibuat dari tanaman yakni ricin A atau saporin.
Imunotoksin lain yakni BL22, juga cukup menjanjikan melalui studi awal untuk
terapi hairy cell leukemia, bahkan pada pasien yang tidak menunjukkan respon
sama sekali dengan kemoterapi. Uji klinis imunotoksin juga tengah berlangsung
untuk jenis leukemia tertentu, limfoma, kanker otak, dan kanker lainnya.
1. Kombinasi Growth Factors/Toksin
Ilmuwan juga melakukan eksperimen dengan racun yang ada kaitannya dengan
substansi serupa hormon, yang sering disebut growth factors. Banyak sel-sel
kanker memiliki reseptor growth factor dalam jumlah besar di permukaan sel yang
akan menstimulasi sel untuk reproduksi dan tumbuh dengan cepat.
Peneliti lantas mengupayakan kombinasi gen sehingga growth factor bisa menempel
pada toksin. Saat kombinasi growth factors/toksin mencapai reseptor growth
factor pada permukaan sel kanker, dia akan menyalurkan muatan racun ke dalam
sel kanker dan membunuhnya. Konsep di belakang obat gabungan growth
factors/toksin ini mirip dengan imunotoksin. Namun karena kombinasi growth
factors/toksin ini tidak mengandung antibodi, obat ini tidak bisa
diklasifikasikan sebagai imunotoksin.
2. Chimeric, Langkah Maju Terapi Antibodi Monoklonal
Hingga kini, keefektifan terapi MAb masih terbatas mengingat fakta bahwa
antibodi diproduksi oleh sel-sel hibridoma mencit. Di awal terapi, antibodi ini
seringkali bekerja baik. Namun pada beberapa kasus, sistem imun mulai mengenali
antibodi mencit ini sebagai “benda asing” setelah pemberian beberapa kali, dan
mulai merusaknya saat “musuh” ini masuk ke dalam tubuh.
Karena alasan ini, ilmuwan mengkombinasikan antibodi mencit yang
bertanggungjawab untuk mengenali antigen tumor spesifik dengan bagian gen
antibodi manusia. Produk gabungan antara gen antibodi manusia dan mencit ini
disebut “chimeric” atau "humanized" monoclonal antibody.
3. Anti-angiogenesis
Anti-angiogenesis adalah proses penghentian pembentukan pembuluh darah baru.
Pada jaringan normal, pembuluh darah baru terbentuk selama pertumbuhan dan
perbaikan jaringan (misalnya ketika proses penyembuhan luka), dan selama
perkembangan janin di masa kehamilan. Pembuluh darah membawa oksigen dan
nutrisi ke jaringan yang diperlukan untuk pertumbuhan dan bertahan hidup.
Demikian juga pada kanker. Tumor membutuhkan pembuluh darah untuk tumbuh dan
bertahan hidup. Melalui proses yang kompleks, sel-sel endotel (yang membentuk
pembuluh darah) bisa membelah diri dan tumbuh membentuk pembuluh darah baru.
Proses ini disebut angiogenesis. Proses ini terjadi baik pada jaringan sehat
maupun pada jaringan kanker.
Beberapa agen anti-angiogenesis yang sudah dikenal seperti dilansir American
Association For Cancer Research, antara lain:
Bevacizumab
Seperti dipaparkan di atas, bevacizumab adalah antibodi monoklonal dengan
target sasaran protein vascular endothelial growth factor (VEGF). Mei 2003,
dari hasil penelitian fase III menunjukkan bahwa bevacizumab secara bermakna
bisa meningkatkan harapan hidup hingga hampir 5 bulan pada pasien kanker
kolorektal stadium lanjut. Agen ini dikombinasikan dengan kemoterapi berbasis
IFL (irinotecan, 5-fluorouracil, dan leucovorin). Selain itu, risiko kematian
dapat dikurangi lebih dari sepertiga (34%) pada kelompok pasien penerima
kombinasi bevacizumab dan IFL dibandingkan pasien yang hanya menerima kemoterapi.
Thalidomide
Efek angiogenesis thalidomide pertama kali dibuktikan pada tahun 50-an, ketika
perempuan hamil yang mengonsumsi obat ini mengalami phicomelia, atau deformitas
kaki akibat penghambatan pembentukan pembuluh darah. Meskipun mekanisme persisnya
belum diketahui, para ahli menjelaskan efek ini didapat dengan menghambat aksi
faktor penting angiogenesis seperti basic fibroblast growth factor dan vascular
endothelial growth factor (VEGF).
α-IFN
α-IFN, merupakan sitokin yang memiliki properti anti-angiogenesis yang sangat
berperan dalam aktivitas penyakit seperti hemangioma, melanoma, renal cell
carcinoma, dan Kaposi’s sarcoma. Beberapa laporan mengindikasikan, kombinasi
α-IFN dengan agen lain seperti thalidomide atau cis-retinoic acid akan menghadirkan
efek anti-angiogenesis yang lebih kuat.
MMP Inhibitors
Matrix metalloproteinases (MMPs) termasuk keluarga zinc-dependent
endopeptidases yang bertanggungjawab menurunkan dan merombak dasar membran dan
matriks ektraseluler. MMPs memegang peran penting dalam tahap perkembangan
metastatik dan juga memfasilitasi neo-angiogenesis. Overekspresi dari MMPs oleh
tumor atau stroma yang berkaitan dengan tumor berdampak pada prognosis yang
memburuk pada beberpa jenis kanker termasuk kanker esofagus, kolon, dan
pankreas.
Tyrosine Kinase Inhibitors
Kabanyakan sel, tremasuk sel kanker, memiliki resptor di permukaan mereka
sebagai epidermal growth factor (EGF), yakni protein yang normalnya diproduksi
oleh tubuh untuk pertumbuhan sel. Jika EGF berikatan dengan epidermal growth
factor receptors (EGFRs), menyebabkan enzim tyrosine kinase menjadi aktif di
dalam sel. Tyrosine kinase adalah enzim yang berada di dalam sel yang berfungsi
mengikat fosfat dengan tirosin asam amino. Tyrosine kinase memicu proses kimia
yang menyebabkan sel –termasuk sel kanker—tumbuh, berlipat ganda, dan menyebar.
Penghambat tyrosin kinase (tyrosine kinase inhibitors) dikembangkan untuk
menghentikan pertumbuhan sel kanker. Dari berbagai studi yang sudah dilakukan
menunjukkan penghambat ini menyebabkan kematian sel dengan cepat, karena
mekanisme bertahan hidup ala kanker di-deaktivasi.
Pengembangan Teknik Produksi dan Aplikasi Antibodi
Monoklonal Ralstonia Solanacearum (RS)
Penyakit layu bakteri yang disebabkan Ralstonia solanacearum (Rs) masih menjadi
kendala produksi tanaman pertanian, misalnya pada kacang tanah, kentang, tomat,
tembakau, pisang dan jahe. Bakteri RS bersifat soil born dan polifaga ini
mempunyai variasi strain yang tinggi, baik berdasarkan kisaran inangnya,
tingkat virulensinya, maupun kemampuan memanfaatkan karbohidrat sebagai
nutrisinya (Machmud 1996). Beberapa mikroba patogen penting lainnya pada
tanaman pangan dan hortikultura juga telah dikoleksi dalam plasma nutfah
mikroba di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya
Genetika Pertanian Bogor. Komponen antigenik dari mikroba tersebut akan
digunakan untuk produksi antibodi bagi pengembangan kit ELISA untuk deteksi
dini dan identifikasi serangan penyakit.
Teknik serologi dan model perangkatnya dengan menggunakan antibodi poliklonal
(PAb)dan monoklonal telah banyak dikembangkan untuk deteksi dan identifikasi
virus dan bakteri patogen utama tanaman. Meskipun teknik ini cukup efektif,
namun penggunaannya dianggap masihsangat mahal karena perangkat kit ELISA-nya
masih tergantung pada produk impor. Di samping itu juga tidak mampu untuk
mendeteksi adanya variasi strain patogen yang ada di lapang yang berkembang
dengan sangat cepat dan bersifat spesifik lokasi. Melalui pembuatan perangkat
kit
ELISA sendiri, permasalahan tersebut dapat teratasi. Teknik dan perangkat yang
akan dikembangkandiharapkan dapat dimanfaatkan oleh peneliti dan pengguna
lainnya, baik untuk keperluanpenelitian maupun untuk penggunaan secara rutin
dan praktis, misalnya deteksi dini patogen di lapang dan deteksi patogen dari
benih untuk keperluan karantina dan sertifikasi benih (Machmudet al. 1999).
Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan salah satu teknik serologi
yang dapat digunakan untuk mendeteksi patogen tanaman secara efektif dan
efisien (Halk dan De Boer 1985). Teknik ELISA dan perangkat deteksinya
menggunakan antibodi poliklonal (PAb) atau McAb telah dikembangkan.secara
komersial untuk deteksi virus dan bakteri patogen tanaman(Martin 1985; Van
Regenmortel 1986). Teknik ELISA juga telah diadopsi di Indonesia, tetapi
perangkatnya masih harus diimpor dengan harga mahal. menggunakan PAb (Machmud
et al.1999).
Penggunaan PAb untuk uji ELISA memiliki beberapa kelemahan, sehingga sejak
tahun1975, teknologi produksi antibodi monoklonal (monoclonal antibody, McAb)
telah dikembangkan (Kohler dan Milsten 1975; Carter dan Ter Meulen 1984;
Gigerli dan Fries 1983). McAb dari PAb diantaranya (1) reaksi McAb dapat dibuat
spesifik strain, dari satu patogen dapat dibuat beberapa McAb dengan
spesifikasi tertentu sesuai kebutuhan; (2) antibodi yang dihasilkan mempunyai
kualitas yang stabil serta berkesinambungan; (3) pasokan antibodi dalam jumlah
besar mudah dilakukan, dan (4) teknologi McAb hanya modal awal yang relatif
mahal, tetapi selanjutnya menjadi murah (Jordan 1990). McAb telah diproduksi
untuk berbagai patogen tanaman termasuk virus, fitoplasma, dan bakteri
(Converse dan Martin 1990; McLaughlin dan Chen 1990).
Pada tahun 1975 Kohler dan Milsten (dalam Jordan 1990a) memperkenalkan teknik
pembiakan sel penghasil antibodi melalui fusi dengan sel mieloma, sehingga
dapat menghasilkan antibodi yang homogen secara terus menerus, bereaksi
serologi yang spesifik serta memiliki ciriciri biokomia tertentu pula.
Hibridisasi sel-sel limposit penghasil antibodi dengan sel miolema (malignant
myeloma cells) menghasilkan sel-sel hibridoma yang menggabungkan sifat-sifat
parental dan kemampuan menghasilkan (mensekresi) antibodi yang spesifik dan
terus tumbuh berkembangbiak. Kloning dan seleksi lebih lanjut sel-sel hibridoma
memberi peluang diproduksinya mAb dengan spesifisitas yang sama (identik) dan
efektifitas sesuai dengan yang diinginkan terhadap epitop tertentu pada antigen
yang digunakan untuk imunisasi (Jordan 1990b). Akhirakhir ini teknik produksi
mAb telah diadopsi untuk produksi mAb patogen tanaman. MAb telah digunakan
untuk mendeteksi dan mengidentifikasi patogen tumbuhan termasuk virus,
fitoplasma,dan bakteri (Converse dan Martin 1990; McLaughlin dan Chen 1990).
Kelebihan teknik produksi mAb dari teknik pAb di antaranya (1) mampu
menghasilkan antibodi dalam jumlah relatif tidak terbatas, (2) kemampuan
melestarikan produksi Ab yang spesisik melalui penyimpanan kriogenik hibridoma
untuk waktu tidak terbatas, (3) kemampuan memproduksi dan menyeleksi mAb untuk
hampir semua determinan antigenik meskipun antigen yang digunakan untuk
imunisasi tidak murni atau merupakan campuran (Jordan 1990a dan 1990b; De Boer
1990). Teknologi hibridoma untuk produksi mAb telah diterapkan pada virologi
dan bakteriologi tumbuhan. McAb sangat bermanfaat untuk identifikasi esei
kualitatif bakteri dan virus tanaman, membedakan tingkat kesamaan antara
anggota berbagai kelompok virus dan bakteri, serta mempelajari struktur dan
fungsi produk gen (Converse dan Martin 1990).
Metodologi yang mencakup pembuatan galur sel (cell lines) yang menghasilkan mAb
secara permanen relatif sederhana, tetapi memerlukan tahapan yang panjang dan
seringkali sulit (crucial). Keberhasilan produksi mAb tidak hanya bergantung
pada produksi galur sel hibridoma dalam jumlah banyak, tetapi juga pada
keberhasilan imunisasi hewan donornya, pengetahuan dan pengalaman dasar tentang
kultur sel (termasuk pembuatan medium, pemeliharaan, dan penyimpanan galur
sel), dan pengembangan teknik serologi yang relatif sederhana, cepat, dan
akurat untuk mengkarakterisasi dan mengidentifikasi antibodi. Penyediaan dan
karakterisasi mAb untuk berbagai antigen tanaman dan patogen dapat dilakukan.
Berbagai publikasi tentang teknik produksi mAb dapat digunakan sebagai bahan acuan
(Jordan 1990a).
Hibridoma merupakan sel yang mudah rusak, memerlukan pengamatan mikroskopik
untuk mengetahui viabilitas dan laju pertumbuhannya. Persyaratan lain untuk
produksi McAb adalah antigen dan esei serologis yang digunakan untuk
mengidentifikasi dan karakterisasi antibodi hibridoma. Sistem esei yang
digunakan sangat tergantung pada jenis antigen dan rencana penggunaan McAb
(Jordan 1990a).
BAHAN DAN METODE
Penelitian dilakukan di Laboratorium Kelti Biokimia, BB-Biogen, Bogor.
Peralatan dan bahan yang digunakan dalam penelitian di antaranya ialah ruang
isolasi (laminar air flow), inkubator CO2 bersuhu 37oC, mikroskop (inverted
microscope), sentrifus meja, otoklaf, waterbath 37- 56oC, alat penyimpanan
kriogenik, alat kering beku (freeze dryer), pendingin (freezer) -15oC dan
-80oC, hemasitometer, spektrofotometer, mikropipet 0-200 μl, mikropipet 1000
μl, multipipettor 8 lubang, filter milllipore ukuran 0,22 μm. Peralatan dan
bahan untuk membiakkan sel hibridoma adalah cawan kultur sel (microplate) bertutup
dengan 96 lubang; botol kultur sel berdiameter 25, 75, dan 150 cm; pipet gelas
atau pipet plastik berukuran 1, 5, 10, dan 25 ml; ampul berukuran 1 ml; tabung
sentrifus bertutup ukuran 5, 15, dan 50 ml; cawan petri bulat dan persegi,
pipet pastur, sarung tangan plastik, spuit plastik berukuran 1, 10, dan 50 ml;
jarum suntik berukuran 26G dan 16G, serta gunting operasi. Di samping peralatan
laboratorium, mencit (tikus putih) hibrida Balb/c, serta ruangan dan kandang
untuk pemeliharaannya juga diperlukan. Mencit sebagai hewan untuk diimunisasi
dan sumber limposit. Bahan-bahan untuk pembuatan sediaan limposit, biakan sel
mieloma, dan biakan sel hibridoma adalah Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
(DMEM), medium Hypoxanthine Aminopterine Thymidine (HAT), antibiotik kanamisin,
serum albumin anak sapi yang baru lahir (Newly-borne Calf Serum, NBS), dan
medium Hypoxanthine Thymidine (HT).
Penyediaan Antigen Contoh tanaman padi terinfeksi RTV dan RS diperoleh dari
koleksi yang ada di Kelti Biokimia, BB-Biogen, yang semula berasal dari lapang
di Sukamandi, Subang dan Serang.Pemurnian RTV dan RS dilakukan menggunakan
teknik pemurnian menurut Saito (1983) yang dimodifikasi.
Imunisasi Mencit Mencit hibrida Balb/c yang diperoleh dari IPB, Bogor,
digunakan untuk diimunisasi. Sediaan murni RS yang digunakan sebagai antigen
diperoleh dari hasil pemurnian yang telah dilakukan sebelumnya. Antigen RS
dilarutkan dalam bufer fosfat salin (Phosphate Buffered Saline, PBS), pH 7,2,
dengan kepekatan 100 ug/ml. Sebelum imunisasi, antigen dicampur dengan Ajuvan
Freund Inkomplit (Incomplete Freund’s Ajuvant, Sigma) dengan perbandingan 1 :
1. Imunisasi danbooster dilakukan sesuai dengan metode Harlow dan Lane (1988)
dengan cara sebagai berikut: antigen RS diberikan secara intraperitonial (i.p)
dengan dosis yang dilaporkan tidak mematikan tetapi imunogen (Dewanti-Hariyadi
et al. 1998), yaitu 25 μg patogen/mencit. Mencit yang digunakan berumur 4-6
minggu dengan menyuntikkan 100 μl (10-20 ug) larutan antigen RS setiap kali
secara intravenal, melalui vena ekor mencit, secara berkala dengan tenggang
waktu satu minggu.Pada minggu 2, 3, 4, 5, dan 6 setelah imunisasi diberikan
booster, yaitu penyuntikan dengan IFA (incomplete Freund’s adjuvant) secara
intraperitonial (i.p). Tiga hari sebelum mencit disakritifikasi untuk diambil
limfanya diberikan booster akhir secara intravena (IV) dengan konsentrasi 10 μg
antigen/mencit.
Persiapan Sel Limposit dari Sel Limpa Mencit Hiperimun Persiapan sel limfosit
dilakukan dengan metode Harlow dan Lane (1988) yang dimodifikasi.Mencit Balb/c
yang sudah diinjeksi antigen RS serta sudah dibooster 4 kali dan diberi booster
akhir secara i.v (umur 6 minggu setelah imunisasi) dimatikan dan direndam dalam
alkohol 70%. Limpa diambil secara aseptik dan dicuci 3 kali dengan media DMEM
tanpa serum. Cara lain yang juga dilakukan untuk mendapatkan sel limfosit
adalah empat hari setelah imunisasi terakhir, 1 ml contoh darah diambil dari
mencit yang telah diimunisasi, dipisahkan dan diuji kandungan (titer)
antiserumnya menggunakan teknik mikropresipitasi. Apabila hasilnya positif dan
titernya cukup tinggi, maka mencit dimatikan dan limpanya (spleen) diambil
secara aseptik dan ditempatkan dalam cawan petri steril berisi 20 ml medium
DMEM tanpa serum NBS (DMEM-NBS). Selanjutnya, secara aseptik pula, limpa yang
masih utuh dan segar dipotong kecil-kecil untuk mengeluarkan sel limpa
(limposit). Potongan-potongan limpa di tekan-tekan (diurut) menggunakan pinset
untuk mengeluarkan limpositnya ke dalam medium. Suspensi limposit disentrifugasi
dengan kecepatan 1000 rpm selama 7 menit dan peletnya dicuci dengan DMEM-NBS
empat kali. Selanjutnya limposit disuspensikan kembali dengan 20 ml DMEM-NBS
dan dihitung kerapatannya menggunakan hemasitometer. Pada percobaan ini
digunakan lima ekor yang masing-masing diimunisasi dengan 100 ug antigen
RS/injeksi.
Persiapan Sel Mieloma Pada hari ke-2 inkubasi, kondisi pertumbuhan, dan
kerapatan sel biakan mieloma SP2 diperiksa. Diperkirakan dua hari ini sel
mieloma tumbuh pada fase log. Contoh biakan diambil dari masing-masing cawan
petri dan jumlah selnya dihitung menggunakan hemositometer. Bila jumlah sel
yang dibutuhkan belum mencukupi, maka disediakan biakan baru dengan menumbuhkan
sel mieloma yang telah ada dalam cawan petri yang berisi media baru. Pada hari
ke-3 inkubasi, populasi sel mieloma diperiksa kembali dan dihitung
kerapatannya, dan pada hari ke-4 inkubasi dilakukan fusi sel. Selanjutnya sel
mieloma yang telah ditumbuhkan hingga fase pertumbuhan logaritmik disentrifusi
dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit dan disuspensikan kembali dalam 20 ml
medium DMEM-serum free dengan volume tertentu dan kerapatan selnya dihitung
dengan hemasitometer.
Fusi Limfosit dengan Mieloma Fusi dilakukan dengan cara mencampurkan sel
mieloma dengan sel limfosit mencit, dengan perbandingan 10 : 1. Campuran sel
disentrifusi dengan kecepatan 1000 rpm pada suhu kamar selama 7 menit.
Selanjutnya supernatan dibuang. Ke dalam tabung berisi pelet sel fusan
ditambahkan 1 ml larutan 50% polietilen glikol (PEG 4000) dalam DMEM-NBS,
setetes demi setetes menggunakan pipet ukur 1 ml sambil digoyang. Penambahan
tersebut, mulai dari tetesan pertama hingga tetesan terakhir, harus dilakukan
dalam rentang waktu 60 detik. Tahapan pemberian PEG adalah sebagai berikut:
detik ke-1 diteteskan satu tetes PEG, detik ke-10 satu tetes
PEG, detik ke-20 satu tetes PEG, detik ke-30 satu tetes PEG, dan detik ke-60
satu tetes PEG lagi, sehingga jumlah volume PEG yang diteteskan dalam satu
menit adalah 1 ml. Penetesan PEG dilakukan sambil menggoyang tabung fusan.
Pengaruh PEG 4000 dikurangi dengan menambahkan 9 ml medium DMEM-NBS sedikit
demi sedikit menggunakan pipet ukur 10 ml dengan rentang waktu 5 menit. Pada
menit ke-1.30 ke dalam tabung ditambahkan 1 tetes medium; menit ke-1.40 1
tetes; menit ke-1.50 1 tetes; dan menit ke-2 1 tetes. Selanjutnya, pada menit
ke-2.40 ditambahkan lagi medium DMEM-NBS hingga pada pipet menunjukkan angka 1;
pada menit ke-3.20 ditambahkan medium hingga angka 2; pada menit ke 4.00
ditambah 2 ml medium hingga angka 4; pada menit ke-4.40 ditambahkan medium 4 ml
hingga angka 8, dan pada menit ke-5 ditambahkan sisa medium hingga angka 10.
Selanjutnya suspensi sel fusan disentrifusi dengan kecepatan 1000 rpm selama 7
menit, supernatannya dibuang dan pelet dalam tabung konus disuspensikan kembali
dengan menambahkan medium HAT (sesuai dengan hasil perhitungan). Kemudian
suspensi didistribusikan ke dalam lubang cawan mikro (microplate) steril dan
bertutup, 100 ml setiap lubang, dan cawan mikro diinkubasikan di dalam
inkubator CO2 bersuhu 37oC.
Pada hari ke-2 dan selanjutnya hingga hari ke1-10 inkubasi, selang dua hari, ke
dalam setiap lubang biakan ditambahkan 100 ml medium HAT. Kemudian pada hari
ke-11 hingga ke-30 pertumbuhan sel hibridoma di setiap lubang cawan diamati
dengan melihat koloni yang tumbuh di dasar lubang, dan lubang yang ditumbuhi
sel hibridoma diberi tanda. Apabila koloni sel hibridoma sudah tumbuh kurang
lebih 1/5 luasan dasar lubang, maka skring (seleksi) hibridoma penghasil McAb
dilakukan.
Perawatan Sel Hibridoma Hasil Fusi Medium sel hibridoma diganti untuk pertama
kalinya pada hari ke-5 setelah fusi dengan cara menganbil media sebanyak 100
ul/sumur dan digantikan dengan medium HAT baru sebanyak 100 ul/sumur.
Penggantian medium selanjutnya dilakukan setiap 3 hari dengan medium HT (HAT
tanpa Aminopterin). Sel hibridoma yang sudah terlalu banyak dalam pelat mikro
96 sumur harus segera dipindahkan ke dalam pelat mikro 24 sumur yang sudah
berisi medium sebanyak 1 ml/sumur. Begitu pula jika sel dalam pelat mikro 24
sumur sudah penuh juga harus segera dipindahkan kedalam pelat mikro 6 sumur
yang sudah berisi medium kultur sebanyak 2 ml/sumur.
Skrining Sel Hibridoma Hibridoma yang tumbuh diharapkan mensekresikan antibodi
ke dalam medium, sehingga cairan medium tempat hibridoma tumbuh mengandung
antibodi. Keberhasilan memperoleh hibridoma penghasil antibodi diperiksa dengan
menguji dengan antigen yang bersangkutan menggunakan teknik Antigen Adsorption
Indirect (AAI)-ELISA dan Indirect Double Antibody Sandwich (IDAS)-ELISA (Jumanto
1998; tidak dipublikasi). Sebagai antigen digunakan ekstrak daun padi
terinfeksi RTV dan sediaan murni RS. Hasil reaksi ELISA diukur menggunakan
spektrofotometer dengan panjang gelombang 415 nm. Reaksi positif (>0)
berarti hibridoma menghasilkan McAb. Akhirnya, lubang cawan biakan hibridoma
yang menghasilkan McAb diberi tanda. Skrining hibridoma penghasil McAb
dilakukan dua kali. Skrining I dilakukan untuk memperoleh hibridoma yang dapat
menghasilkan McAb. Skrining II dilakukan dengan cara yang sama dengan skrining
I, tetapi untuk memilih kembali sel hibridoma penghasil McAb yang potensial
menghasilkan McAb tinggi dan stabil, dari koloni hibridoma penghasil McAb yang
diperoleh pada seleksi I.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Produksi, Seleksi, dan Karakterisasi Sel Hibridoma Penghasil McAb RS
Hasil yang dicapai pada dua kegiatan, di mana antara kegiatan yang ke satu
dengan kegiatan kedua diharapkan memiliki capaian yang sama, yaitu antibodi
monoklonal yang spesifik terhadap RTV dan RS. Pada penelitian ini tahapan kegiatan
yang dilakukan ada 6 enam tahapan, yaitu purifikasi antigen, immunisasi,
penyediaan dan perbanyakan mieloma, fusi sel limposit dan sel mieloma,
hibridisasi, skrining hibridoma. Hanya saja pada tahapan untuk mendapatkan
antigen yang berbeda.
Pada kegiatan 2, antigen RS diperoleh dari hasil isolasi bakteri Ralstonia
solanacearum dari tanaman kacang tanah yang berasal dari Bogor dan sekitarnya.
Kemudian dilakukan seleksi terhadap ras patogen yang ada. Isolat ini
diperbanyak dengan membiakkan pada cawan petri berisi medium Sukrose Pepton
Agar (SPA) (Lelliot dan Stead 1987). Biakan R. solanacearum (Gambar3) umur 48
jam dipanen dengan menambahkan 10 ml akuades steril kedalam tiap cawan biakan.
Suspensi biakan ini diamati dengan menggunakan standart Mc. Farlan sampai
diperoleh biakan dengan optikal densiti 107. Biakan dikeruk dengan jarum ose
sambil diaduk, kemudian suspensi bakteri dipindahkan ke tabung sentrifus steril
dan diaduk menggunakan vortex mixer hingga menjadi suspensi yang homogen.
Selanjutnya suspensi bakteri ini dicuci tiga kali dengan larutan 0,1 N bufer
fospat salin (Phosphate Buffered Saline, PBS) dengan pH 7,2 melalui
sentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm masing-masing selama 10 menit. Akhirnya
pelet bakteri disuspensikan kembali dalam PBS steril hingga kepekatannya +1010
sel/ml dan disimpan pada suhu -15oC untuk digunakan sebagai stok antigen.
Sebelum imunisasi mencit, larutan stok antigen dicairkan, diambil sebagian
untuk diencerkan dengan PBS steril sehingga kerapatan selnya +106-108 sel/ml.
Enceran antigen ini digunakan untuk imunisasi mencit.
Imunisasi Mencit. Mencit (tikus putih) hibrida Balb/c yang diperoleh dari IPB,
Bogor, digunakan imunisasi dengan sediaan murni RTV dan RS. Untuk RTV
menggunakan enam ekor mencit dan untuk RS menggunakan 4 ekor mencit. Sediaan
murni RTV dan RS yang digunakan sebagai antigen diperoleh dari hasil pemurnian
yang telah dilakukan pada penelitian sebelumnya dan penelitian tahun 2004.
Antigen RTV dan RS dilarutkan dalam bufer fosfat salin (Phosphate Buffered
Saline, PBS), pH 7.2. Sebelum imunisasi, antigen dicampur dengan Ajuvan Freund
Inkomplit (Incomplete Freund’s Ajuvant, Sigma) dengan perbandingan 1 : 1.
Imunisasi dilakukan pada mencit umur 4 minggu dengan menyuntikkan 100 μl (10-20
ug) larutan antigen RTV dan RS setiap kali secara intraperitonial, melalui vena
ekor mencit, secara berkala dengan tenggang waktu satu minggu. Imunisasi
dilakukan empat kali. Pada saat imunisasi RTV kedua sebanyak tiga ekor mencit
mati yang sisa 4 ekor (Tabel 1). Keadaan ini memicu untuk dilakukan modifikasi
mengenai konsentrasi antigen yang akan diinjeksikan. Injeksi dilakukan dengan
konsentrasi antigen RTV 5, 10, 15, dan 20 ug. Dari hasil optimasi konsentrasi
antigen RTV yang baik untuk disuntikan adalah konsentrasi 10 ug.
Perbanyakan mieloma. Sel-sel mieloma diperbanyak dengan membiakkan dalam media
RPMI 1640 yang mengandung NBS/FSC dan L-glutamine. Dari hasil beberapa optimasi
diperoleh sel mieloma yang cukup banyak dan baik (Gambar 4). Pada fase
pertumbuhan dihitung populasi sel nya. Saat ini sebanyak 57 ampul sel mieloma
disimpan dalam kondisi kriogenik dalam tabung nitrgen cair, namun dalam proses
mengaktifkan kembali sel dari ampul tersebut masih mengalami kendala di mana
selnya banyak mengalami kematian. Sel yang tersisa sedang ditumbuhkan kembali
untuk bahan fusi sel dalam medium DMEM. Saat ini bersamaan dengan pertumbuhan
sel mieloma diupayakan juga perbanyakan mencit BALB C baru untuk bahan produksi
sel limposit.
Sel Hibridoma Setelah dilakukan pencampuran sel mieloma dengan limposit mencit
(fusi) diperoleh sel hibridoma (Gambar 5). Memasuki hari ke-15 pertumbuhan sel
baru mencapai 1/10 luasan cawan. Hasil ini belum maksimal. Memasuki hari ke 20
pertumbuhan sel mengalami hambatan, hal inidikarenakan terjadi penurunan konsentrasi
gas CO2 yang disebabkan terjadi kebocoran alat.Tahapan fusi sel perlu diulang
kembali.
Skrining Sel Hibridoma Sel hibridoma yang tumbuh pada saat ini belum banyak
sehingga skrining hibridoma penghasil MCAb RTV dan RS perlu diulang. Hal ini
disebabkan karena jumlah sel hibridoma yang diharapkan sebanyak 1/5 dari luasan
cawan petri belum didapat. Sel yang ada masih sedikit pertumbuhannya belum
optimal dan terkendala dengan alat yang ada. Akan tetapi teknik perbanyakannya
sudah diperoleh hanya saja masih perlu dilakukan modifikasi. Proliferasi sel
hasil fusi masih rendah sehingga belum memungkinkan untuk dilakukan skrining
sel hibridoma. Skrining dilakukan untuk mengetahui titer antibodi sel hibridoma
yang diperoleh dari hasil fusi mencit Balb/c dengan sel mieloma SP2. Pengujian
spesifisitas antibodi merupakan hal penting pada produkasi antibodi monoklonal.
Antibodi monoklonal yang spesifik menurut Morris dan Clifford (1985) hanya akan
bereaksi dengan antigen pembentuknya. Antigen yang benar-benar spesifik sangat
jarang ditemukan dikatakan pula bahwa sebagian besar antibodi bereaksi silang
dengan metabolit, fragmen atau molekul-molekul lain yang memiliki kesamaan
urutan asam amino. Reaksi silang terjadi karena kesamaan epitop antara bakteri
maupun
virus. Sesama golongan masih dimungkinkan terjadi reaksi silang.
